Окислително фосфорилиране

Окислителното фосфорилиране е процес, в който енергията, отделяща се при окислението в дихателната верига, се използва за фосфорилиране на АДФ до АТФ. Така клетката временно съхранява енергия във форма, удобна за използване.

Същност на процеса

При движението на електроните по дихателната верига се освобождава енергия – АТФ. Тя се отделя на порции, разпределена по съответните звена (стъпала) на веригата. Така енергията може да се използва рационално и по предназначение от организма. Образуването на АТФ е свързано с фосфорилиране на АДФ, като енергията за тази реакция е резултат от окислителните реакции в дихателната верига. Основна част от енергията, която използват клетките на аеробни организми, се освобождава в митохондриите в резултат на пренасянето на електрони от НАД.Н₂ и ФАДН₂ (в митохондриите Цикъл на Кребс, бета-окисление на мастни киселини) до крайния окислител – кислорода. Особената организация на електронтранспортната верига - редица от окислително-редукционни преносители, подреди в 4 комплекса по нарастващ редокс-потенциал, позволява отделяне на енергията на малки порции. Така тя може да бъде уловена, преобразувана и временно съхранена в макроергичните връзки на АТФ.

Натрупването на енергия в макроергично съединение (АТФ) може да бъде представено чрез уравнението:

АДФ + Фн + енергия ⇌ АТФ

същност на окислителното фосфорилиране

Оттук се вижда, че синтезът на АТФ включва реакцията на фосфорилиране на АДФ (свързване на АДФ с неорганичен фосфат). Енергията, необходима за това фосфорилиране, се отделя в окислителните реакции, протичащи в дихателната верига на митохондриите. Това е причината процесът да се нарича окислително фосфорилиране.

Механизъм на окислителното фосфорилиране

Окислителното фосфорилиране се осъществява във вътрешната митохондриална мембрана на митохондриите. Движещата сила и енергия за процеса осигурява движението на електронния поток в дихателните вериги.

Протоните, които се намират в матрикса преминават в междумембранното пространство. То се изпълва с протони,  защото вътрешната мембрана не е пропусклива за тях. Така междумембранното пространство се зарежда (+). Отрицателните електрони пък определят (–) заряд на мембраната към матрикса. Създава се разлика между заряда от двете страни  на  вътрешната митохондриална мембрана – електро-химичен потенциал, притежаващ значителна енергия. Така енергията от пренасянето на електрони се превръща в енергия на митохондриалната мембрана.

Натрупаните в междумембранното пространство Н⁺ обаче се стремят да се върнат в матрикса. Това практически е невъзможно, поради непропускливостта на вътрешната митохондриална мембрана за тях. Едиственият им път е през белтъчен комплекс – АТФ-синтазен, наречен АТФ-синтаза (ензимът е синтаза, а не синтетаза поради това че не използва енергия от АТФ).

Наблюдаван под електронен микроскоп с едната си част той се вгражда в мембраната, а другата е гъбовидно образувание, насочено към матрикса.  АТФ – синтетазен  комплекс пренася  Н⁺ в матрикса. Това преминаване е свързано с отделяне на енергия, която “придвижва” фосфорния остатък до АДФ (фосфорилиане).

Енергията за синтеза на АТФ е освободената енергия от процесите на биологичното окисление, която е трансформирана в макроергични връзки. Върналите се в матрикса Н⁺ се свързват с редуцирания кислород и образуват вода.

схема на окислително фосфорилиране

Окислителното фофорилиране е процес, който се извършва във вътрешната митохондриална мембрана, свързан е със синтеза на АТФ, за която се използва енергията  от окислитените реакции на дихателните вериги.

Аеробното разграждане на глюкозата доказва високата енергийна ефективност на аеробните процеси.

Компоненти на дихателната верига

Електроните преминават през дихателната верига през редокс потенциал от 1,1 V от НАД⁺ /NADH до O₂ /2H₂O, преминавайки през три големи протеинови комплекси: НАДH-Q оксидоредуктаза (Комплекс I), където електроните се прехвърлят от НАДH на коензим Q (Q) (наричан също убихинон); Q-цитохром с оксидоредуктаза (Комплекс III), който предава електроните на цитохром с; и цитохром с оксидаза (Комплекс IV), който завършва веригата, предавайки електроните на O₂ и което води до редуцирането му до H₂O. Някои субстрати с по-положителни редокс потенциали от НАД⁺ / НАДH (напр. сукцинат, глицеерол-3-фосфат, ацил-КоА) подават електрони до Q чрез четвърти комплекс, сукцинат-Q редуктаза (Комплекс II), по-скоро отколкото чрез Комплекс I. Четирите комплекса са вградени във вътрешната митохондриална мембрана, но Q и цитохром c са мобилни. Q дифундира бързо в мембраната, докато цитохром c е разтворим протеин.

Флавопротеините и желязо-сярните протеини (Fe-S) са Компоненти на дихателно верижните комплекси. Флавопротеините са важни компоненти на Комплекси I и II. Окисленият флавинов нуклеотид (флавин мононуклеотид [ФМН] или флавин аденин динуклеотид [ФАД]) може да бъде редуциран в реакции, включващи прехвърлянето на два електрона (за да образуват ФМНH₂ или ФАДH₂), но те могат също приемат един електрон за да образуват семиухинон. Желязо-сярни протеини (нехемни желязо протеинит, Fe-S) са установени в Комплекси I, II и III. Те могат да съдържат един, два или четири Fe атома, свързани с неорганични серни атоми и / или чрез цистеин-SH групи към протеина. Fe-S участват в единични реакции на пренос на електрон в който един Fe атом претърпя оксидоредукция между Fe²⁺ и Fe³⁺.

Коензим Q приема електрони чрез комплекси I и II

НАДH-Q оксидоредуктаза или комплекс I е голям L-образен мултимерен протеин, който катализира преноса на електрони от НАДH към Q и по време на процесът четири Н⁺ се прехвърлят през мембраната в междумембранно пространство:

НАДH + Q + 5H⁺ _{матрикс} → НАД + QH2 + 4H⁺ _{междумембранно пространство}

Електроните се прехвърлят първоначално от НАДH към ФМН, след това в поредица от Fe-S центрове и накрая до Q. В комплекс II (сукцинат-Q редуктаза), ФАДH2 се образува по време на превръщането на сукцинат във фумарат в Цикъла на лимонената киселина и електроните след това преминават през няколко Fe-S центъра към Q. Глицерол-3-фосфат (генериран при разграждането на триацилглицероли или от гликолиза) и ацил-КоА също предават електрони на Q по различни пътища включващи флавопротеини.

Q цикъл спряга прехвърляне на електрони с протонен Транспорт в комплекс III

Електрони се предават от QH2 на цитохром с чрез Комплекс III (Q-цитохром с оксидоредуктаза):

QH2 + 2Cytc_oxidized + 2H⁺_matrix -à Q + 2Cytc_reduced + 4H⁺_{intermembrane space}

Смята се, че процесът включва цитохроми с₁, b_L и b_H и Rieske Fe-S (необичаен Fe-S, в който един от Fe атомите е свързан с два хистидинови остатъка, а не два цистеинови остатъка) и е известен като Q цикъл. Q може да съществува в три форми:

окислен хинон, редуциран хинол или семихинон. Семихинонът се образува преходно по време на цикъла, един оборот от който води до окисляване на 2QH₂ до Q, отделяйки 4Н⁺ в междумембранно пространство и редукцията на един Q до QH₂, водещо  до свързване на 2H⁺ от матрикса. Имайте в предвид, че докато Q носи два електрона, цитохромите носят само един, като по този начин окисляването на един QH₂ се спряга с редукцията на две молекули цитохром с чрез Q цикълът.

Молекулярният кислород се редуцира до вода чрез Комплекс IV

Редуцираният цитохром с се окислява чрез Комплекс IV (цитохром с оксидаза), с едновременното редуциране на O₂ до две молекули вода:

4Cyt c_reduced + O₂ + 8H⁺_matrix -à 4Cytc_oxidized + 2H₂O + 4H⁺_{intermembrane space} Четири електрона се прехвърлят от цитохром с на О₂ чрез двe хем-инови групи, a и a₃ и Cu. Първоначално електроните се предават на Cu център (Cu_A), който съдържа 2Cu атоми, свързани с два протеин цистеинови- SH групи (наподобяващи Fe-S), след това в последователност към хем a, хем a₃, втори Cu център, Cu_B, който е свързан с хем a₃ и накрая с O₂. Осем Н⁺ се отстраняват от матрикса, от които четири се използват за образуване на две молекули вода и четири се изпомпват в междумембранното пространство. По този начин, за всеки чифт електрони, преминаващи по веригата от НАДH или ФАДH₂, 2H⁺ се изпомпват през мембраната от Комплекс IV. О₂ остава здраво свързан с Комплекс IV до пълното му редуциране и това свежда до минимум освобождаването на потенциално увреждащи междинни продукти като супероксидни анийони или пероксид, които се образуват, когато О₂ приема един или два електрона, съответно.

Окислително фосфорилиране - АТФ синтаза

Химиосмотичната теория, предложена от Питър Мичъл през 1961 г., постулира, че двата процеса са спрегнати чрез протонен градиент през вътрешната митохондриална мембрана така че протонната движеща сила, причинена от електрохимичнита потенциална разлика (отрицателна от страната на матрикса) задвижва механизма на АТФ синтез.Комплекси I, III и IV действат като протонни помпи, движейки Н⁺ от митохондриалната матрикс към междумембраното пространство. Тъй като вътрешната митохондриална мембрана е непропосклива за йони като цяло и особенно за протони,  те се натрупват в междумембранното пространство, създавайки протонната движеща сила, предвидена от химиосматичната теория.

Функция ATP синтазата, разположена на мембрана е като ротационен мотор за формирането на АТФ. Протонната движеща сила задвижва мембранно разположена АТФ синтаза, която образува АТФ в присъствието на Ф_н + АДФ. АТФ синтазата е вградена във вътрешна мембрана, заедно с комплексите на дихателната верига. Няколко субединици на протеина образуват формата на топка, подредена около ос, известна като F1, която се проектира в матрикса и съдържа механизма на фосфорилиране. F₁ от говежди митохондрии е изградена от 9 субединици от 5 различни типа - α, β, γ, δ, ε в конфигурация α₃β₃γδε. F₁ е прикрепена към мембранен протеинов комплекс, известен като F_о (о - от антибиотикът олигомицин, инхибитор на субединицата), който също се състои от няколко протеинови субединици. F_о преминава през  мембраната и образува протонен канал, изгарден от три вида субединици: a, b и c в съотношение a₁b₂c_10-12. Кагато протоните протичат през F_о, задвижвани от протонния градиент през мембрана, тя се завърта (ротира), задвижвайки продукцията на АТФ в F1 комплексът. Смята се, че това се случва чрез свързване променящ се механизъм, при който конформацията на β субединиците във F1 се променя като оста се завърта от една, която свързва здраво АТФ към тази, която освобождава АТФ и свързва АДФ и Ф_н, така че да може да се формира следващата молекула АТФ. Както е посочено по-горе, за всеки окислен НАДH, комплекс I и III транслокира четири Н⁺ (протона) всеки и Комплекс IV премества два.

Дихателната верига осигурява по-голямата част от енергията, запазена в резултат на катаболизъмът

АДФ улавя под формата на високоенергиен фосфат, значително част от свободната енергия, отделяна при катаболните процеси. Полученият в резултат АТФ се нарича енергийна „валута“ на клетката, защото тя предава тази свободна енергия за задвижване на процеси, изискващи енергия. Има нетно директно улавяне на две високоенергийни фосфатни групи в гликолитични реакции. Още два високоенергийни фосфата на мол глюкоза се улавят в Цикъла на лимонената киселина по време на

превръщане на сукцинил-CoA в сукцинат (субстратно фосфорилиране).

За всеки мол субстрат окисляващ се чрез Комплекси I, III и IV в дихателната верига (т.е. чрез НАДH), се образуват 2,5 mol АТФ на 0,5 мол консумиран O₂, т.е.съотношението P: O = 2,5 (Коефициент на окислително фосфорилиране).

От друга страна, когато 1 mol субстрат (напр. сукцинат или 3-фофоглицерат) се окислява чрез Комплекси II, III и IV, само 1,5 mol АТФ се образуват, т. е. Р: О = 1,5.

Тези реакции са известни като окислително фосфорилиране в дихателната верига. Като се вземат предвид тези стойности, може да се изчисли че почти 90% от високоенергийните фосфати, продуцирани от пълното окисление на 1 мол глюкоза се получават чрез окислително фосфорилиране спрегнато с дихателната верига (виж ТаблицаГликолиза).

Дихателен контрол

Дихателен контрол осигурява постоянна доставка на АТФ. Скоростта на дишане в митохондриите може да се контролира от наличността на АДФ или съотношението АДФ + Фн/АТФ. Това е така, защото окислението и фосфорилирането са тясно спрегнати; това означава, че окислението не може да продължи през дихателната верига без съпътстващо фосфорилиране на АДФ. Повечето клетки в състоянието на покой контролират дишането чрез наличността на АДФ. Когато се извършва работа, АТФ се преобразува в АДФ, позволявайки да се стимулира дишането в ДВ, което от своя страна попълва запасите от АТФ. При определени условия концентрацията на неорганичен фосфат може да повлияе и на скоростта на функциониране на дихателната верига. Когато

дишането се увеличава (както е при упражнения), клетката се приближава до състояние 3 или 5, когато или капацитетът на дихателната верига се насища, или PO₂ (парциално налягане на кислорода) намалява под Km за хем a₃.

Съществува и възможността АДФ/АТФ транспортерът, който улеснява навлизането на цитозолен АДФ  и АТФ извън митохондриите, да е скорост лимитиращ.

Така начинът, по който биологично окислителните процеси позволяват свободната енергия, получена от окисляването на хранителните продукти, да стане достъпна и да бъдете запазена поетапно, ефективно и контролирано, а не експлозивно,

неефективено и неконтролирано, както в много небиологични процеси. Оставащата свободна енергия, която не се запазва под формата на високоенергиен фосфат се освобождава като топлина. Тя не трябва да се разгрежда като „пропиляна“ енергия, тъй като гарантира че дихателната система като цяло е достатъчно екзергонична, за да бъде отстранена от равновесието, позволявайки непрекъснат еднопосочен поток и постоянно осигуряване на АТФ. Освен това допринася за поддържане на телесната температура.

Таблица: Състояния на дихателния контрол.

Състояния лимитиращи нивото на клетъчно дишане
Състояние 1	Наличност на АДФ и субстрат
Състояние 2	Наличност само на субстрат
Състояние 3	Капацитет на самата ДВ, когато всички субстрати и компоненти присъстват в насищащи количества
Състояние 4	Наличност само на АДФ
Състояние 5	Наличност само на кислород

Отрови инхибиращи дихателната  верига

Получена е много информация за дихателната верига чрез употребата  на инхибиторите, и, обратното, това е дало знания за механизъм на действие на няколко отрови (Фигура 13–9). Те могат да се класифицират като инхибитори на дихателната верига, инхибитори на окислителното фосфорилиране или разпрягащи окислителното фосфорилиране.

Барбитурати като амобарбитал инхибират транспорта на електрони през Комплекс I, като блокира прехвърлянето от Fe-S на Q. При достатъчна доза, са фатални.

Антимицин А и димеркапрол инхибират дихателната верига в Комплекс III.

Класическите отрови H₂S, въглероден монооксид и цианид, наподобяващи по структура кислорът, инхибират Комплекс IV и следователно могат напълно да спрат дишането.

Малонат е конкурентен инхибитор на Комплекс II.

Атрактилозидът инхибира окислителното фосфорилиране чрез инхибиране на транспортерът на АДФ в и АТФ извън митохондриите.

Антибиотикът олигомицин напълно блокира окислението и фосфорилиране чрез блокиране потокът на протони през АТФ синтаза.

Разпрягащите агенти дисоциират окислението в дихателната верига от фосфорилирането. Тези съединения са токсични, причиняващи дишането да стане неконтролирано, тъй като скоростта вече не се ограничава от концентрацията на АДФ или Ф_н. Разпрягащият агент, който се използва най-често е 2,4-динитрофенол, но други съединения действат по подобен начин. Термогенинът (или разпрягащ протеин 1; UCP1) е физиологичен разпрягащ протеин, открит в кафявата мастна тъкан, която функционира за генерирането на телесната топлина, особено при новородени и по време на зимен сън при животни. Разликата в електрохимичния потенциал на мембраната, веднъж установени в резултат на транслокацията на протони, инхибира по-нататъшният транспорт на редуциращи еквиваленти през дихателната верига, освен ако не се освободят от обратно транслокиране на протони през мембраната през АТФ синтаза. Това от своя страна зависи от наличието на АДФ и Ф_н. Разпрягащите агенти (напр. Динитрофенол) са амфипатични и увеличената пропускливост на липоидната вътрешна митохондриална мембрана за протони, като по този начин намалява електрохимичния потенциал и шънтвайки АТФ синтазата. По този начин окислението може да продължи без фосфорилиране.

Совалки прехвърлящи цитозолен НАДН

Окисляването на екстрамитохондриалния НАДH се медиира от субстратни совалки НАДH не може да проникне в митохондриалната мембрана, но се получава непрекъснато в цитозола от 3-фосфоглицералдехид  дехидрогеназа, ензим в реакциите на гликолизата. Въпреки това, при аеробни условия, екстрамитохондриалният НАДН не се натрупва и се предполага, че се окислява от дихателната верига в митохондриите. Прехвърлянето на редуциращи еквиваленти през митохондриалната мембрана изисква двойки субстрати, свързани с подходящи дехидрогенази от всяка страна на митохондриалната мембрана. Механизмът на прехвърляне с помощта на глицерофосфатна совалка - поради това че митохондриалният ензим е свързан с дихателната верига чрез флавопротеин вместо НАД, само 1,5 мол, а не 2,5 мол АТФ се образуват на атом на консумирания кислород. Въпреки че тази совалка присъства в някои тъкани (напр. мозък, бяла мускулатура), при други (напр. сърдечен мускул) тя е дефицитна. Следователно се счита, че системата на малатната совалка е по-универсална. Сложността на тази система се дължи на непроницаемостта на митохондриалната мембрана за оксалоацетат, който трябва да реагира с глутамат, за да образува аспартат и α-кетоглутарат чрез трансаминиране преди транспортиране през митохондриалната мембрана и раеконституция на оксалоацетат в цитозолът.

Креатин фосфатната совалка гарантира функциите на креатин фосфата като енергиен буфер, като действа като динамична система за прехвърляне на високоенергиен фосфат от митохондриите в активни тъкани като сърдечен и скелетен мускул. Изоензим на креатин киназата (CKm) се намира в митохондриалното междумембранно пространство, катализиращо трансферът на високоенергиен фосфат към креатин от АТФ, избягвайки адениновият нуклеотиден транспортер. От своя страна, креатин фосфатът се транспортира в цитозола чрез протеинови пори във външната митохондриална мембрана, ставайки достъпен за генерирането на екстрамитохондриален АТФ.

Заболявания

Състоянието, известно като фатална инфантилна митохондриална миопатия и бъбречната дисфункция включва силно намаляване или липса на повечето оксидоредуктази на дихателната верига. MELAS (митохондриалена енцефалопатия, лактатна ацидоза и инфаркт) е наследствено състояние, дължащо се на НАДH-Q оксидоредуктаза (Комплекс I) или цитохром оксидаза (Комплекс IV) дефицит. Причинява се от мутация в митохондриалната ДНК (кодираща по-голямата част от протеините участващи в структората на ДВ) и може да участва в болестта на Алцхаймер и захарния диабет. Редица лекарства и отрови действат чрез инхибиране на окислителното фосфорилиране.

Източници

1. Mitchell P, Moyle J (1967). "Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation". Nature. 213 (5072): 137–9.
2. Rich PR (2003). "The molecular machinery of Keilin's respiratory chain". Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6): 1095–105.
3. Gupte S, Wu ES, Hoechli L, Hoechli M, Jacobson K, Sowers AE, Hackenbrock CR (1984). "Relationship between lateral diffusion, collision frequency, and electron transfer of mitochondrial inner membrane oxidation-reduction components". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81 (9): 2606–10.

механизъм на окислителното фосфорилиране