Полимеразна верижна реакция

от Уикипедия, свободната енциклопедия
Направо към: навигация, търсене

Полимеразната верижна реакция (Polymerase Chain Reaction, PCR) е експериментален метод от молекулярната биология и молекулната диагностика. Реакцията е открита от Кари Мулис. Тя се състои от няколко стъпки, след които броят на началните ДНК молекули е увеличен. Това е необходимо, когато няма на разположение достатъчно ДНК за експерименти и анализ.

Методът се състои в ин витро ензимно намножаване (амплификация) на избрани нуклеотидни последователности, ограничени от известни секвенции.

Компоненти[редактиране | edit source]

Във всяка амплификационна реакция участват:

  • ДНК — матрица за осъществявания процес, получена след топлинна денатурация на специфична ДНК.
  • Taq-полимераза — осъществява процеса на копиране на желаната ДНК последователност. За първи път е изолирана от микроорганизма Termophylus aquaticus. Ензимът Taq-полимераза е термостабилен и запазва своята активност от 45 до 60 минути при 94°С — т.е. през целия амплификационен процес. Оптималната температура за синтез с Taq-полимеразата е 72°С.
  • Праймери (зародиши) — представляват къси синтетични олигонуклеотиди (14—40 нуклеотида), комплементарни на ограничаващите намножаваната последователност участъци. От тях започва синтеза на ДНК при всеки нов цикъл на PCR-реакцията. Оптималната концентрация на праймерите в амплификационната реакция е 0,1 — 1,0 μМ.
  • Дезоксирибонуклеотидтрифосфати — дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ — Служат като субстрат за изграждане на новосинтезиращата се верига, като се включват избирателно на принципа на комплементарност. Задължително условие е четирите типа дНТФ да присъстват в еквимоларни количества в реакционната смес. Оптималната концентрация е 20 до 200 μМ за всеки нуклеотид.
  • Реакционен буфер — осигурява подходящото pH=8,3 — 9,0 на средата и необходимите йони за работа на ензима. Включва в състава си 10-50 mM Tris-HCl с рН=8,3-9,0 ; до 50mM KCl и 0,5-5,0 mM MgCl2. Освен това, може да съдържа и желатин, говежди серумен албумин (BSA), нейонни детергенти (като DMSO — диметил сулфооксид) и други. Компонентите на буфера могат да варират качествено и количествено, в зависимост от изискванията на конкретната Taq-полимераза.

Етапи[редактиране | edit source]

Полимеразната верижна реакция започва с първоначална продължителна денатурация, която цели разделяне на двойната верига на ДНК. Амплифицирането на желания участък се осъществява при условия на многократно повтаряне на серия от цикли с определена температура, всеки от които включва следните три стъпки:

  1. Термична денатурация (denaturation)
    При 90 до 97°С се осигурява пълно разделяне на двойноверижната ДНК до едноверижни матрици за амплификация;
  2. Хибридизация (annealing)
    Осъществява се между праймерите и комплементарните им участъци от матричната едноверижна ДНК. Температурата на това взаимодействие е строго специфична и се изчислява в зависимост от базовия състав и дължината на използваните праймерни секвенции. Емпирично тя може да бъде изчислена по следната формула:
    tCannealing = (A+T)x2+(G+C)x4-5C
  3. Синтез (extension)
    Синтезиране на нова, комплементарна на матричната ДНК-верига е в посока 5→3. Температурата на този етап се определя от особеностите на използвания ензим и осигурява най-високата активност на ДНК-полимеразата. Обикновено температурата е около 72°С.
  • Крайна фаза

Обикновено след последният цикъл температурата се задържа на 72°C от 5 до 15 мин. Това се прави с цел завършване на частично елонгираните продукти. След PCR епруветките се съхраняват при -20°С.