Афинитетна хроматография

от Уикипедия, свободната енциклопедия
Направо към: навигация, търсене

Хроматография[редактиране | edit source]

Биомолекулите се пречистват с помощта на различни техники на пречистване в зависимост от специфичните им свойства:


качества- техники Биоразпознаване (лигандна специфичност)- Афинитетна хроматография Заряд -Йоннообменна хроматография Размер- Гелфилтрация (изключване на размера) хидрофобност- Хидрофобно взаимодействие – обратнофазова хроматография{|


Афинитетна хроматография[редактиране | edit source]

Афинитетната хроматография разделя белтъците на базата на обратимо взаимодействие между белтък или група от белтъци и специфичен лиганд, свързан с хроматографската матрица. Тази техника предлага висока селективност и капацитивност.

Афинитетната хроматография е изключителна сред техниките за пречистване, тъй като е единствената, която дава възможност пречистването да се извърши на базата на биологичната функция или собствената химическа структура на биомолекулите.

Биологичното взаимодействие между лиганда и лигата може да бъде резултат от електростатични или хидрофобни взаимодействия, вандерваалсови сили или водородни връзки. За да се освободи лигата от афинитетната среда реакцията може да бъде обърната, както специфично, използвайки конкурентен лиганд, така и неспецифично – със смяна на рН, йонната сила или полярността на разтвора.

Афинитетното очистване предлага спестяване на време в сравнение с многостъпалните процеси. Ефектът на концентрация позволява да бъдат обработени големи количества. Молекулите могат да бъдат пречистени от комплексни биологични смеси, нативни форми могат да бъдат разделяни от денатърирани форми от същата субстанция и малки количества от биологичния материал може да бъде пречистен от замърсяване.

За по-висока степен на пречистване, или когато не разполагаме с подходящ лиганд за афинитетно пречистване, трябва да бъде предприет многостъпален процес.

Успешното афинитетно пречистване изисква биоспецифичен лиганд, който може да бъде ковалентно свързан с хроматографската матрица. Сдвоените лиганди трябва да запазят специфичния си афинитет към връзката на изследваната молекула и след елуиране на насвързания материал; връзката между лиганда и лигата трябва да бъде обратима, за да могат молекулите да бъдат отделени в активна форма. Всеки компонент може да се използва като лиганд.

Типично биологични взаимодействия, използвани в афинитетната хроматография: • ензим-субстратен аналог, инхибитор, кофактор • антитяло-антиген, вирус, клетка • лецитин-полизахарид, глюкопротеин, клетъчен рецептор • НК- комплементарен участък от бази, хистони, НК-полимераза, НК-свързващи белтъци • хормони, вит. С- рецептор, транспортен белтък


Афинитетната хроматография се използва за премахване на специфични замърсители (бензамидинсефароза отстранява серинова протеаза, също тромбин и фактор Хо).


Често срещани термини в афинитетната хроматография


Свързване: буферното състояние позволява молекулата да взаимидейства ефективно с лиганда и се запазват с афинитетната среда, докато другите моелкуле се елуират (отмиват) от колоната; Елуиране: буферното състояние се сменя, за дасе разхлабят връзките между лиганда и лигата, за да може впоследствие лигата да се отмие от колоната; Лигандно свързване: ковалентно свързване на лиганда към подходяща преактивирана матрица за създаване на афинитетна среда; Преактивирана матрица: матрица, която е химически модифицирана, за да улесни сдвояването на специфичните типове лиганди.

Афинитетната хроматография на практика

Стъпки на пречистване:

1. Афинитетната среда се уравновесява при свързването и с буфер.


2. Пробата е поставена в условия, които благоприятстват специфичната връзка между лиганда и лигата. Лигатът се свързва специфично и обратимо с лиганда, а несвързаният материал се отмива от колоната.


3. Белтъкът се възстаножяжа при промяна на условията, за да благоприятства елуирането на свързаните молекули. Елуирането е представено специфично , изпозвайки конкурентен лиганд, или неспецифично- сменяйки pH, йонната сила или полярността на разтвора. Белтъкът се събира в пречистена, концентрирана форма.


4. Афинитетната среда се реуравновесява със свързващ буфер.


Елуиране Няма общ план на елуиране в афинитетната хроматография. Методите на елуиране могат да бъдат селективни и неселективни. Методи: 1. Смяната на буферната композиция елуира свързаната субстанция без да увреди нея или лиганда. 2. Екстремално pH или високи концентрации от хаотропни агенти се изискват за елуирането, но те могат да доведат до временни или трайни увреждания. 3. и 4. Специфично елуиране чрез прибавяне на субстанции, които конкурират свързването. Тези методи могат да повишат специфичността на средата, която използва груповоспецифични лиганди.

Когато субстанциите са здраво свързани кум афинитетната среда, от олза може да бъде да се спре теченето за известно жреме (10 мин. до 2 ч.) преди поставяне на елуент. Това дава възможност да се осъществи дисоциация. Методите за селективно елуиране се използват в комбинация с груповоспецифични лиганди, а тези за неселективно елуиране- с високоспецифични лиганди. Комплексът се поддържа от електростатични, хидрофобни взаимодействия и водородни връзки.

рН- елуиране Смяната на рН изменя степента на йонизация на заредените групи на лиганда и/или на лигата. Тази промяна може да засегна директно местата за свързване, да намали тяхното сродство или да причини индиректни промени в афинитета с редуване на конформациите. Постепенното намаляване на рН е най-често срещания метод за елуиране на свързани субстанции. Химическата стабилност на матрицата, лиганда и лигата определя макс. рН което миже да се изпозва. Ако трябва да бъде използвано ниско рН фракциите се събират в неутрализационен буфер – 1М HCl, pH=9 (60-200μl за ml елуирана фракция), за да върнем фракцията към неутрално рН. Колоната също трябжа да бъде незабавно уравновесена до неутрално рН.

Йонна сила

Точният механизъм на елуиране със смяна на йонната сила ще зависи от специфичните взаимодействия между лиганда и лигата. Това е меко елуиране, използващо буфер с нарастваща йонна сила (NaCl). Ензимите обикновено се елуират при 1М NaCl или по-малка концентрация.

Конкурентно елуиране

Селективни елуенти се използват за разделяне на субстанции в група специфични среди афинитетът на свързване на лиганд-лигат взаимодействието е много висок. Елуираният агент се конкурира за свързване с лиганда или лигата. Когато работим конкърентно елуиране концентрацията на конкурентните агенти трябва да е близка до тази на двойките лиганд-лигат.


Редуциране полярността на елуента

Намаляването на полярността на елуента спомага за елуиране без инактивиране на елуираните субстанции (диоксан 10% или етилен гликол 50%).

Хаотропно елуиране

Хаотропни агенти (гуанидинхидрохлорид или уреа) се използват за деформиране на буфери, с което се променя структурата на белтъците. Хаотропте трябва да бъдат избягвани, когато е възможно, защото водят до денатуриране на белтъците.


Скорост на течене

Не е възможно да се определи една единствена скорост на течене в афинитетната хроматография, защото степените на дисоциация на взаимодействията лиганд-лигат варират широко. Препоръчва се: • да се определи оптималната степен на течене, за да се постигне ефективно свързване и за елуиране до максимално възстановяване • да се определи максималната степен на течене за колонно възстановяване, така че да се намали работното време.

Пречистване на специфични групи молекули

Групата от специфични среди има афинитет към група от свързани субстанции повече,отколкото към единична молекула.Същият основен лиганд може да се използва за пречистване на няколко субстанции (пр.представителите от един ензимен клас) без да се нуждае от приготвяне на ножа среда за жсяка субстанция в групата.Съществува структорно и функционално подобие между членовете от всяка група.Специфичността на афинитетната среда произлиза от селиктивността на лиганда и използването на избирателни състояния на елуента.

Имуноглобулини

Разнообразието от взаимодействия от типа антиген-антитяло е създало много възможности за използването на антитела и техните фрагменти. Те се използват за терапевтични и диагностични цели, както и за имунохимични техники. Използването на рекомбинантни технологии разширява нашата възможност да манипулираме характеристиките на тези молекули за наше предимство. Потенциалът съществува, за да създаде голям брой от комбинации между имуноглобулините и техните фрагменти със свободен край и други селектирани белтъци.


IgG, IgG – фрагменти и подкласове

Основата на пречистването на IgG, IgG-фрагменти и подкласове е високото сходство на белтъците А и G за Fc-областта от поликлоналния и моноклоналния IgG – вид антитела. Белтъците А и G са бактериални белтъци ( от Staphilococcus aureus и Streptococcus), които свързани с сефароза, създават лесно използваема среда за редица рутинни дейности. Примери включват пречистването на моноклонални IgG – антитела, поликлонални IgG, подкласове и адсорбцията и пречистването на имунен комплекс, включващ IgG. IgG може да бъде изолиран от супернатантна клетъчна култура и серум.


Моноклонален IgM от хибридна клетъчна култура

Техниката е оптимизирана за пречистване на моноклонална IgM от хибридна клетъчна култура, но тя може да се използва като отправна точка за определяне на връзките и условията на елуиране, необходипи за други IgM подготовки.


HiTrap IgM пречистващите НР колони са пакетирани с тиофилна адсорбционна среда (2-меркаптопиридин свързан със сефароза). Взаимодействието между белтъка и лиганда води до комбинирано електрон донорно-акцепторно и хидрофилно-хидрофобно взаимодействие на лиганда.

Пробата трябва да има същата концентрация на амониев сулфат, каквато и свързващия буфер. Бавно се добавя амониев сулфат на малки порции към пробата от хибридна клетъчна култура докато краината концентрация не достигне 0,8M (това се прави за да не се постигне преципитация на пробата). Пробата незабавно се пропуска през филтър преди да се пусне в колоната.


Птичи IgY от яйчен жълтък

HiTrap IgY пречистващите НР колони са пакетирани с тиофилна адсорбционна среда (2-меркаптопиридин свързан със сефароза). И тук взаимодействието между белтъка и лиганда води до комбинирано електрон донорно-акцепторно и хидрофилно-хидрофобно взаимодействие на лиганда.

Преди пречистването трябва да се премахне възможно по-голямо количество от липидите в яйчния жълтък. Вода или полиетиленгликол могат да бъдат изпозвани за преципитиране на липидите.

Рекомбинантно слети белтъци

Пречистването на рекомбинантни белтъци може често да бъде опростено при включване на свободен край на познат модел към белтъка. Главната роля на свободния край е да не позволи пречистване на пробата при афинитетната хроматография. Двата най-често срещани свободни края са глутатион-6-тарнсфераза и . Белтък А слети белтъци се произвеждат за да вземат преимущество на афинитет между IgG и белтък А за афинитетно пречистване.


Реферат по ИМРАБ към ХТМУ- гр.София