Рестрикционна ендонуклеаза

от Уикипедия, свободната енциклопедия
Jump to navigation Jump to search

Рестрикционните ендонуклеази (съкр. рестриктази) са група от ензими, отговорни за специфичното разкъсване на ДНК молекули до отделни полинуклеотидни фрагменти.

В действителност рестрикционните ендонуклеази разпознават къса ДНК секвенция, в която най-често се извършва и самият каталитичен акт, но е възможно мястото на разпознаване (разпознавателна секвенция) да е пространствено отдалечено от мястото на разкъсване.

Познати са около 3500 рестрикционни ензими, разпознаващи над 250 различни ДНК секвенции. Рестриктазите са характерни за клетките на еубактериите, но са изолирани и ензими от вируси, архебактерии и от еукариотни организми. Статистическите данни сочат, че около 25% от всички бактерии съдържат поне един вид рестрикционна ендонуклеаза, а при някои бактериални щамове броят в отделната клетка може да достигне седем и повече.

Рестрикционните ендонуклеази се превръщат в необходим инструмент на генното инженерство непосредствено след откриването им. Периодът в който за пръв път се изолират ензими с ендонуклеазна активност е предшестван от откритието на феномен известен като контролирана рестриктивна модификация. Този феномен е описан от Лурия и Бертани при отглеждане на бактериофаги върху различни бактериални щамове.

Значението на рестрикционните ендонуклеази за ДНК-клонинга в молекулярната биология е официално признато през 1978 г., когато Хамилтън Смит и Даниел Натанс поделят Нобеловата награда за физиология или медицина, отсъдена за техния принос в откриването на рестрикционните ендонуклеази и внедряването им в практиката.

Типове[редактиране | редактиране на кода]

   Ензимната номенклатура на NC-IUBMB класифицира рестрикционните ендонуклеази, като хидролази, действащи върху естерни връзки от вътрешността на полинуклеотидната верига на дезоксирибонуклеиновата киселина и продуциращи 5’-фосфомоноестерни фрагменти. Това корелира с ензимен клас 3.1.21.-- , в който попадат 6 индентификатора на ензими. Основните рестрикционни ензими са означени като място-специфични ендодезоксирибонуклеази от тип I, II и III, с индентификационни номера съответно 3.1.21.3, 3.1.21.4 и 3.1.21.5.

Забележка: Разграничават се и рестриктази от тип IV, но до 2005 г. NC-IUBMB все още не посочва индентификационен номер на класа.

   Формално това са три ензима, всеки със своя характерна структура на субединиците, кофакторни изисквания, рестрикционна специфика и тип на асоциирана S-аденозилметионин: ДНК метилтрансфераза. Но именно поради специфичността на участъка, в който става разпознаването и вида на рестрикционните продукти във всеки един от типовете I, II и III могат да се диференцират отделни ензими, които показват различна активност спрямо секвенцията на субстрата (в случая ДНК). За това коректно е да се говори за рестрикционни ендонуклеази от тип I, II и III.

   Съществува група ензими, означавана като самонасочващи се ендонуклеази (homing endonucleases). Това са рестриктази, кодирани от интронни или интеинни последователности, формирани чрез автосплайсинг (на англ. self-splicing) и ясно диференцируеми от познатите рестрикционни нуклеази от тип I, II и III.

Номенклатура[редактиране | редактиране на кода]

Номенклатурните изисквания към името на рестрикционните ендонуклеази отразяват по кратък и екзактен начин, биологичният вид от който е изолиран съответният ензим и типът на евентулен щам. За означаване на биологичният вид се използва трибуквена абревиатура, чиято първа буква е взаимствана от родовото име, а втората и третата буква представляват съкратен запис на видовото име на микроорганизма (или и на подвидовото при определени случаи). Ако е необходимо да се цитира точно определен щам, това става чрез арабски цифри и латински букви, изписани след трибуквения код. С римски цифри се отбелязва съответна рестриктаза в случай, че от конкретния организъм могат да бъдат изолирани няколко.

Например:

Рестриктаза Организъм
AaaI Acetobacter aceti sub. aceti – първа рестриктаза
Eco24I Escherichia coli RFL24 – първа рестриктаза
Eco47I Escherichia coli RFL47 – първа рестриктаза
Eco47II Escherichia coli RFL47 – втора рестриктаза
Eco47III Escherichia coli RFL47 – трета рестриктаза
EcoKI Escherichia coli K MG1655 – първа рестриктаза
EcoRII Escherichia coli R245 – втора рестриктаза

При много специфични случаи на интрон или интеин кодираните ендонуклеази се използва префикс, с които се означава типа на ендонуклеазата. Той може да бъде I– (за интрон), PI- (протеинов инсерт) или F- (freestanding – свободна, некодирана в интрон или интеин, но в еукариотен организъм). Като примери могат да бъдат посочени:

Рестриктаза Организъм
I-AniI Aspergillus nidulans – първа рестриктаза
I-CpaII Chlamydomonas pallidostigmatica – втора рестриктаза
PI-SceII Saccaromyces cerevisae – втора рестриктаза
F-SceII Saccaromyces cerevisae – втора рестриктаза

Разпознавателна секвенция[редактиране | редактиране на кода]

Това е специфична ДНК секвенция, която се разпознава от ензима. Наличието ѝ в определен ДНК фрагмент, определя дали рестрикционната ендонуклеаза ще реагира и ще разкъса фрагмента. Минималната дължина на такава секвенция е 4 нуклеотидни двойки, най-често срещаната дължина е 6 н.дв., но има и разпознавателни секвенции от 8 и много повече нуклеотида.

   Повечето рестрикционни ендонуклеази реагират с участъци от ДНК, означавани като палиндромни или частично палиндромни. Палиндромът е полинуклеотидна секвенция, която се повтаря и в двете вериги на ДНК, носейки една и съща информация при четене строго в една посока (5’->3’) по дължината на веригата (т.е. всяка последователност, която има симетрия от втори ред). Като пример за палиндромни участъци могат да бъдат посочени следните таргетни последователности:

5' – Г А А Т Т Ц – 3'   EcoRІ   (E.coli)

3' – Ц Т Т А А Г – 5'

5' – Ц А Г Ц Т Г – 3'   PvuІІ   (Proteus vulgaris)

3' – Г Т Ц Г А Ц – 5'

   Частично палиндромен е участък, в който има неспецифични нуклеотиди, нарушаващи симетрията от втори ред. В лингвистичен смисъл това са палиндроми (вж. палиндром), но в контекста на структурата на ДНК, разликите са съществени. Така например ензима StyI изолиран от Salmonella typhi 27, разпознава следните последователности:

5' – Ц Ц Т А Г Г – 3'   (палиндром)

3' – Г Г А Т Ц Ц – 5'

5' – Ц Ц А А Г Г – 3'      5' – Ц Ц Т Т Г Г – 3'   (частични палиндроми)

3' – Г Г Т Т Ц Ц – 3'      5' – Г Г А А Ц Ц – 3'

Т.е. реално ензима реагира на последователност 5' – Ц Ц W W Г Г – 3', където W = А или Т.Записана по такъв начин, секвенцията може да се разглежда като палиндром или да се превърне в палиндром при заместване с конкретни нуклеотиди (нарича се още палиндром с двусмислие).

   Съществува и разпознавателна секвенция, означавана като прекъснат палиндром. Тя представлява участък с нарушена симетрия от втори ред поради наличието на вмъкнати, несъществени нуклеотиди, които най-общо се означават с лат. буква „N“. Броят на тези вмъкнати нуклеотиди може да бъде от 1 до 9. Например:

5’ – Ц А Ц N N N Г Т Г – 3’   AdeI   (Alcaligenes denitrificans Ss 3 – 028)

3’ – Г Т Г N N N Ц А Ц – 5’

   Друг тип прицелни последователности са двустранните разпознавателни секвенции. Това са прекъснати последователности без палиндромна симетрия в специфичните нуклеотиди. Като пример може да се посочи разпознавателната секвенция на ензима BcgI, изолиран от Bacillus coagulans:

5’ – (N)10 Ц Г А (N)6 Т Г Ц (N)12 – 3’   BcgІ   (Bacillus coagulans)

3’ – (N)12 Г Ц Т (N)6 А Ц Г (N)10 – 5’

   Съществува и тип разпознавателна секвенция, която се означава като непалендромна – това е непрекъсната последователност, която не притежава симетрия от втори ред, но характеризираща се със специфични нуклеотиди:

5’- Ц Т Г Г А Г – 3’   Bco35I   (Bacillus coagulans RFL35)

3’- Г А Ц Ц Т Ц – 5’

Външни препратки[редактиране | редактиране на кода]